黄酮检测方法围绕 “定性鉴别、定量分析” 两大核心，依据检测精度、操作复杂度及应用场景分为三大类，广泛应用于食品、中药、保健品等领域。检测核心是利用黄酮类化合物的多酚结构特性(如与金属离子显色、紫外吸收)，实现从快速筛查到准确定量的全需求覆盖，为产品质量管控与功效评估提供技术支撑。
经典化学检测方法(操作简便、成本较低)
(一)定性鉴别方法
盐酸 - 镁粉反应法：
原理：黄酮类化合物在盐酸酸性条件下与镁粉反应生成红色至紫红色络合物;
操作：取样品提取液(乙醇或水提取)2mL，加入少许镁粉振摇，滴加浓盐酸数滴，若 5 分钟内出现红色至紫红色，可初步判定含黄酮类化合物(查耳酮、橙酮类除外);
适用场景：中药、植物提取物的快速定性筛查，如银杏叶、山楂、葛根等，成本极低、操作仅需 5 分钟。
三氯化铝显色法：
原理：黄酮类化合物与 Al³⁺形成黄色络合物，在紫外光下显荧光;
操作：样品提取液中滴加 1% 三氯化铝乙醇溶液，若出现黄色沉淀或显色，且紫外光下显黄绿色荧光，可确证含黄酮类化合物;
特点：特异性较强，可区分黄酮与其他多酚类物质，适合实验室初步定性。
(二)定量分析方法
铝盐显色比色法（GB/T 20574-2006）：
原理：黄酮与三氯化铝形成稳定络合物，在 415nm 波长下有特征吸收，吸光度与浓度呈线性关系;
操作：样品经乙醇回流提取、过滤，取上清液加入三氯化铝 - 醋酸钾显色体系，室温反应 30 分钟，在 415nm 处测定吸光度，通过芦丁标准曲线(0.01-0.1mg/mL)计算总黄酮含量;
适用场景：食品、保健品中总黄酮的常规定量，如黄酮饮料、葛根粉，操作简便(耗时约 1 小时)，是行业常用标准方法。
亚硝酸钠 - 硝酸铝比色法：
原理：黄酮类化合物在碱性条件下与亚硝酸钠、硝酸铝反应生成红色络合物;
操作：样品提取液中依次加入亚硝酸钠、硝酸铝溶液，摇匀后加入氢氧化钠溶液，显色后在 510nm 波长下测定吸光度，外标法计算含量;
特点：显色稳定、灵敏度较高(检测限 0.005mg/mL)，但需严格控制反应 pH 值，避免碱性过强导致误差。
仪器分析检测方法(准确度高、适用范围广)
紫外 - 可见分光光度法（UV-Vis）：
原理：黄酮类化合物因苯环与吡喃酮环的共轭结构，在 250-270nm(苯环)和 300-330nm(吡喃酮环)有特征吸收峰;
操作：样品经提取、纯化后，直接测定特征波长下的吸光度，通过芦丁标准曲线定量，或利用不同 pH 值下的吸收光谱差异定性;
适用场景：总黄酮快速定量，检测限 0.001mg/mL，无需复杂前处理，适合大批量样品筛查(耗时约 30 分钟)。
高效液相色谱法（HPLC）：
原理：不同黄酮单体(如芦丁、槲皮素、山奈酚)在反相色谱柱(C18)中保留时间不同，按保留时间定性、峰面积定量;
操作：样品用甲醇超声提取，经 0.45μm 滤膜过滤，以甲醇 - 0.1% 磷酸水溶液(梯度洗脱：甲醇 30%-80%)为流动相，流速 1.0mL/min，检测波长 254nm 或 360nm，外标法计算单体含量;
特点：特异性强、分离效果好，可同时测定多种黄酮单体，适用于复杂基质样品(如中药复方、加工食品)，检测限低至 0.0001mg/mL。
液相色谱 - 串联质谱法（LC-MS/MS）：
原理：黄酮类化合物经色谱分离后，通过质谱电离生成特征离子碎片，按母离子 - 子离子对定性，多反应监测模式(MRM)定量;
操作：样品经固相萃取净化后，采用电喷雾离子源(ESI⁻)，设定特定离子对(如芦丁：609.1→301.0)，外标法或内标法计算含量;
适用场景：痕量黄酮单体检测、复杂样品中黄酮异构体分离，如生物体液(血浆、尿液)中黄酮代谢物检测，检测限可达 0.00001mg/mL。
毛细管电泳法（CE）：
原理：利用黄酮类化合物的带电性差异，在高压电场中实现分离;
操作：以硼砂缓冲液(pH8.5)为运行缓冲液，分离电压 20kV，检测波长 254nm，通过迁移时间定性、峰面积定量;
特点：分离速度快(单次检测≤20 分钟)、溶剂消耗少，适合黄酮单体快速分离与定量，尤其适用于极性较强的黄酮苷类。
快速筛查检测方法(便携高效、适合现场检测)
胶体金免疫层析法：
原理：基于抗原抗体特异性结合，将黄酮特异性抗体固定于试纸条检测线，与样品中黄酮结合后形成红色条带;
操作：样品提取液滴加至试纸条加样孔，10 分钟内观察结果，出现红色条带为阳性(含黄酮)，无条带为阴性;
适用场景：现场质量抽检、食品添加剂快速筛查，检测限 0.1mg/mL，无需仪器，操作便捷。
近红外光谱法（NIRS）：
原理：黄酮类化合物在近红外区域(780-2526nm)有特征吸收，通过光谱数据与含量的相关性模型定量;
操作：样品无需前处理，直接扫描近红外光谱，代入预先建立的定量模型(如偏较小二乘法 PLS)，快速输出总黄酮含量;
特点：无损检测、快速高效(单次检测≤1 分钟)，适合生产过程中实时监控，但需提前建立专属模型，初期投入较高。
不同检测方法对比与选择建议
|
方法类型 |
代表方法 |
检测限 |
操作复杂度 |
适用场景 |
|
经典化学法 |
铝盐显色比色法 |
0.005mg/mL |
低 |
常规样品总黄酮定量、标准方法 |
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分光光度法 |
UV-Vis |
0.001mg/mL |
低 |
大批量样品快速筛查 |
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仪器分析法 |
HPLC/LC-MS/MS |
0.00001mg/mL |
中 - 高 |
单体分离、准确定量、痕量检测 |
|
快速筛查法 |
胶体金试纸条 / 近红外光谱 |
0.1mg/mL/0.01mg/mL |
极低 - 低 |
现场检测、生产实时监控 |
黄酮检测方法涵盖经典化学法、仪器分析法与快速筛查法，各有侧重：化学法适合常规定量，仪器法准确度高，快速法便携高效。需根据检测需求(定性 / 定量、精度、场景)选择，规范操作可保障结果可靠，满足多领域质量管控需求。
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检测流程步骤
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